概述

重組腺相關(guān)病毒（rAAV）已成為體內(nèi)基因治療的主要遞送平臺(tái)。rAAV基因療法藥物Glybera（Alipogene Tiparvovec，由uniQure公司研發(fā)）于2012年獲歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)，用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥。2018年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了在美國(guó)上市的rAAV基因療法Luxturna（Voretigene neparvovec-rzyl）。

(圖1：rAAV介入性基因治療臨床試驗(yàn)概覽，引用自Wang, D.等人2019年的研究)

AAV載體基礎(chǔ)

AAV屬于細(xì)小病毒科依賴(lài)病毒屬，是一種無(wú)包膜的小型DNA病毒，基因組大小約為4.7 kb。AAV載體是基于AAV基因組改造的基因遞送工具。

•   基因組結(jié)構(gòu)：兩端含有反向末端重復(fù)序列（ITR），其中D序列與病毒基因組的高效釋放、選擇性復(fù)制和包裝密切相關(guān)；編碼區(qū)包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼4種Rep蛋白（負(fù)責(zé)基因組復(fù)制）和3種Cap蛋白（負(fù)責(zé)病毒組裝與包裝）。

•   載體設(shè)計(jì)：在設(shè)計(jì)載體時(shí)，需要將編碼區(qū)替換為靶基因及相關(guān)功能片段，僅保留兩端的反向末端重復(fù)序列。

•   生產(chǎn)方式：通常采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，即將包含AAV載體基因組的質(zhì)粒、腺病毒輔助基因質(zhì)粒、以及表達(dá)CAP和REP蛋白的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

•   血清型：目前已發(fā)現(xiàn)13種AAV血清型（AAV1至AAV13），它們可以靶向不同的受體和組織。在制備載體時(shí)，需要根據(jù)疾病部位和靶組織選擇合適的血清型。

AAV載體在基因治療中的應(yīng)用

•   基因替換：通過(guò)將治療基因遞送至靶細(xì)胞，利用染色體同源重組替代功能缺陷的基因。這主要適用于隱性單基因遺傳病。

•   基因編輯：參與DNA修復(fù)過(guò)程，遞送包含靶序列同源重組臂和治療基因的基因組，通常還會(huì)與Cas9蛋白編碼序列共同遞送，用于直接修復(fù)致病的基因突變。

•   基因沉默：以RNA干擾（RNAi）為核心機(jī)制，在mRNA水平上調(diào)控基因表達(dá)，從而下調(diào)致病基因的表達(dá)。

•   基因添加：通過(guò)補(bǔ)充功能性基因來(lái)治療復(fù)雜的遺傳病或獲得性疾病。除了單基因病外，該策略已在對(duì)HIV感染的臨床測(cè)試中展開(kāi)。

AAV的免疫原性

1. 野生型AAV預(yù)存免疫

人類(lèi)普遍存在針對(duì)野生型AAV的免疫記憶。

•   體液免疫：約有30%-60%的人群攜帶抗AAV2中和抗體。由于不同血清型的衣殼氨基酸序列和結(jié)構(gòu)高度同源，導(dǎo)致中和抗體之間存在廣泛的交叉反應(yīng)。

•   細(xì)胞免疫：可以通過(guò)ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到針對(duì)AAV1和AAV2的特異性T細(xì)胞。這類(lèi)T細(xì)胞具有記憶表型，在脾臟等外周免疫器官中更為常見(jiàn)，且在成人和兒童中的檢出水平相似。

2. AAV載體誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答

•   先天免疫：載體的核酸成分會(huì)通過(guò)病原體相關(guān)分子模式（PAMP）被免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體（PRR）識(shí)別，進(jìn)而激活NF-κB和IRF轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子或I型干擾素的表達(dá)，可能引發(fā)炎癥反應(yīng)。

•   適應(yīng)性免疫：抗原提呈細(xì)胞（APC）提呈衣殼蛋白表位，激活CD8?細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4?輔助T細(xì)胞，介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞清除被AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，引起靶器官炎癥，從而降低基因轉(zhuǎn)移的持續(xù)時(shí)間和療效。

3. 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫應(yīng)答

免疫原性受到宿主因素（如基礎(chǔ)疾病、遺傳背景）和載體因素（如靶器官、啟動(dòng)子的組織特異性）的共同影響。相比免疫豁免器官（如肝臟）的局部給藥，全身或肌肉注射載體的免疫原性顯著更高。

AAV免疫檢測(cè)

AAV載體的免疫原性是臨床應(yīng)用的核心障礙之一，需要通過(guò)基線免疫參數(shù)檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)治療方案。

•   檢測(cè)方法：包括體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制（TI）試驗(yàn)、小鼠體內(nèi)TI試驗(yàn)，以及基于ELISA的抗衣殼總抗體（TAb）檢測(cè)。

•   產(chǎn)品支持：創(chuàng)迪診斷提供全系列的AAV抗體（可識(shí)別完整病毒衣殼、病毒亞基及復(fù)制酶），以及多血清型的AAV滴度ELISA試劑盒。

核心產(chǎn)品列表

AAV抗體

•   DMAB6350：抗AAV1（完整顆粒）單抗，克隆BEL2b，小鼠來(lái)源?？勺R(shí)別AAV1、AAV6、AAV12的完整衣殼（包括空殼和實(shí)心顆粒）。

•   DMAB-CS24040：Magic™ 抗AAV2（完整顆粒）單抗，克隆26H5，兔來(lái)源。識(shí)別AAV2構(gòu)象表位，不與AAV1、5、6、8、9、DJ、rh.1發(fā)生交叉反應(yīng)。

•   CABT-B9062：抗AAV2（完整顆粒）單抗，克隆B31，小鼠來(lái)源?？勺R(shí)別AAV2、AAV2 7m8、AAV3的完整顆粒（空殼/實(shí)心）。

•   DPAB2423：抗AAV2 VP1/VP2/VP3多抗，兔來(lái)源。識(shí)別變性的VP1/VP2/VP3蛋白，覆蓋AAV1、2、3、5、6、7、8、9、rh10、DJ、rh74等多種血清型。

AAV抗原（VLP/ELISA對(duì)照）

•   DAG-WT823：重組AAV1型病毒樣顆粒。

•   DAGC256：AAV2衣殼（用于ELISA對(duì)照）。

•   DAGC259：AAV8衣殼（用于ELISA對(duì)照）。

AAV抗體ELISA試劑盒

•   DEIASL345：人抗AAV8抗體ELISA試劑盒，用于定性檢測(cè)。

•   DEIASL348：小鼠抗AAV9抗體ELISA試劑盒，用于定性檢測(cè)。

•   DEIASL347：人抗AAV2抗體ELISA試劑盒，用于定性檢測(cè)。

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